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牛性控精液生产工艺
点击次数: 更新时间:2015/7/16 15:09:44
近年来，牛性控精液的商业化进程发展很快，一般常用于青年母牛配种，以生产母犊。但是，由于精子分离速度慢，与传统精液比较，性控精液精子量少，使用性控精液输精常常会导致受胎率略有下降，获得可用胚胎数量减少。因此，为确保使用性控精液成功，必须对牛加强饲养管理，处理精液小心谨慎，而且输精人员技术要熟练。
1、原理
目前，分离动物X、Y精子最有效的方法是应用改进后的流式细胞仪。它根据X、Y精子DNA含量的差异，借助特异染色剂染色，经过染色的精子通过流式细胞仪时由于喷嘴产生高频率震动，高速喷射出的液流形成包含单个X精子或者Y精子的微小液滴逐个与激光交截，精子上的荧光染料被紫外光激发会产生激发光。由于X精子上所含有的DNA比Y精子多，结合的荧光染料就多，所激发出的荧光强度比Y精子强。激发光被正、侧两个光电倍增管接受后放大荧光信号，同时将接受到的信号传入主机，根据其荧光强度的差别分别辨出X精子和Y精子。同时，给被判别的包含单个X精子或者Y精子的微小液滴加载正电荷或者负电荷携带正电荷或者负电荷精子的液滴在电厂力的引导小，分别落入不同的收集容器中，使X精子和Y精子得以分离。
2、性控精液生产过程
2.1、鲜精处理
种公牛选择以体型外貌、精液质量以及后裔成绩为主要条件。
将采精员采集的精液通过专用传递窗口送到处理室，首先肉眼观察精液的颜色，合格鲜精的色泽要求为乳白色或稍带淡黄色，其它颜色视为不合格。然后检查活力及密度。鲜精在35.5℃条件下，在20~40倍显微镜下观察活力，每个样片观察5个视野，并观察不同液层内的精子活动状况；活力≥60%，没有粘连的鲜精可以用于进行分离，使用分光光度计测定原精液密度，密度8~15亿/ml时分离效果较好。
2.2荧光染料染色
经过品质评定后，根据原精液量的多少，添加混合抗生素，摇匀后放入18℃恒温避光保存备用。使用前将加入Hoechst33342染料的稀释液（staining）与正常比例的原精混合以及Buffer，放入34℃水浴锅内预热45分钟。
2.3精子分离操作
调试流式细胞仪激光系统、流体系统及电学控制系统、调整液流、做液滴的分选、drop值等参数，调试到所需要的范围内。
2.3.1 激光系统控制
将激光功率调整至适当大小，以提高牛精子分离速度和分离准确度。
2.3.2 流体系统操作
调试sheath液罐使其正压表显示为 40.7，废液罐负压表显示在40.0之间。
如果出现压力不稳定，可能是sheath液罐和废液罐盖子没有拧紧；连接管路漏气；上样口密封不严；压缩机出现问题等原因造成的。
2.3.3 电学控制系统操作
开启电学工作台，设置分离单元参数使之达到：频率 65,000～68,000HZ 之间、振幅 30V 左右、相位 20 左右、左右偏转角度 20%～40%、电压±3,000V、分离方式21+1\16～23+1/16drop。
2.3.4 调液流
不断调整 DeFanning、Center、DD frea、DD Ampl 和 phase 五个旋钮，直至将液流呈现出 3 股不分叉的直线即可。在整个调节过程中保证系统没有气泡，进样量在 30000 个左右，电极板不沾水珠，带电电压为 3000V，液流偏转角度不宜过大，一般在 20%～35%左右具佳。
2.3.5 做液滴的时间延迟
使用荧光微球，计算精子液滴分离时的时间延迟。荧光微球的流速控制在 150～200 个/秒左右，保证屏幕中液流位置恒定。如果液滴监视器的液流总是在变化，可能是风速或者温度变化太快造成的。
2.3.6 分选
R1 门应只圈住蓝色和后面捎带黄色区域，不可圈的过大、过宽。
R2 门应只圈住中上部区域，其圆圈图形不易过大，周围零散的星星点点不要包括进去，那可能不是精子而是其他杂质产生的荧光信号。
注意分选过程中进样量在30000 个/秒之间，液滴延迟位置不发生变化，以确保纯度。
如只取 X 精子样品，则其余精子（Y 精子、死精子）流入废液罐。X 精子样品用 2ml 含 20%卵黄的 Tris-A 液回收。分取结束时卵黄的最终浓度得保证在 3%以上。为提高冷冻后精液的活力，每隔15 分钟轻轻摇动一次。当死精率达到 25%以上时停止分离，换新样品。在分选过程中，随时观察液流、图像、死精率等变化，及时调整，保证分选质量。
1、原理
目前，分离动物X、Y精子最有效的方法是应用改进后的流式细胞仪。它根据X、Y精子DNA含量的差异，借助特异染色剂染色，经过染色的精子通过流式细胞仪时由于喷嘴产生高频率震动，高速喷射出的液流形成包含单个X精子或者Y精子的微小液滴逐个与激光交截，精子上的荧光染料被紫外光激发会产生激发光。由于X精子上所含有的DNA比Y精子多，结合的荧光染料就多，所激发出的荧光强度比Y精子强。激发光被正、侧两个光电倍增管接受后放大荧光信号，同时将接受到的信号传入主机，根据其荧光强度的差别分别辨出X精子和Y精子。同时，给被判别的包含单个X精子或者Y精子的微小液滴加载正电荷或者负电荷携带正电荷或者负电荷精子的液滴在电厂力的引导小，分别落入不同的收集容器中，使X精子和Y精子得以分离。
2、性控精液生产过程
2.1、鲜精处理
种公牛选择以体型外貌、精液质量以及后裔成绩为主要条件。
将采精员采集的精液通过专用传递窗口送到处理室，首先肉眼观察精液的颜色，合格鲜精的色泽要求为乳白色或稍带淡黄色，其它颜色视为不合格。然后检查活力及密度。鲜精在35.5℃条件下，在20~40倍显微镜下观察活力，每个样片观察5个视野，并观察不同液层内的精子活动状况；活力≥60%，没有粘连的鲜精可以用于进行分离，使用分光光度计测定原精液密度，密度8~15亿/ml时分离效果较好。
2.2荧光染料染色
经过品质评定后，根据原精液量的多少，添加混合抗生素，摇匀后放入18℃恒温避光保存备用。使用前将加入Hoechst33342染料的稀释液（staining）与正常比例的原精混合以及Buffer，放入34℃水浴锅内预热45分钟。
2.3精子分离操作
调试流式细胞仪激光系统、流体系统及电学控制系统、调整液流、做液滴的分选、drop值等参数，调试到所需要的范围内。
2.3.1 激光系统控制
将激光功率调整至适当大小，以提高牛精子分离速度和分离准确度。
2.3.2 流体系统操作
调试sheath液罐使其正压表显示为 40.7，废液罐负压表显示在40.0之间。
如果出现压力不稳定，可能是sheath液罐和废液罐盖子没有拧紧；连接管路漏气；上样口密封不严；压缩机出现问题等原因造成的。
2.3.3 电学控制系统操作
开启电学工作台，设置分离单元参数使之达到：频率 65,000～68,000HZ 之间、振幅 30V 左右、相位 20 左右、左右偏转角度 20%～40%、电压±3,000V、分离方式21+1\16～23+1/16drop。
2.3.4 调液流
不断调整 DeFanning、Center、DD frea、DD Ampl 和 phase 五个旋钮，直至将液流呈现出 3 股不分叉的直线即可。在整个调节过程中保证系统没有气泡，进样量在 30000 个左右，电极板不沾水珠，带电电压为 3000V，液流偏转角度不宜过大，一般在 20%～35%左右具佳。
2.3.5 做液滴的时间延迟
使用荧光微球，计算精子液滴分离时的时间延迟。荧光微球的流速控制在 150～200 个/秒左右，保证屏幕中液流位置恒定。如果液滴监视器的液流总是在变化，可能是风速或者温度变化太快造成的。
2.3.6 分选
R1 门应只圈住蓝色和后面捎带黄色区域，不可圈的过大、过宽。
R2 门应只圈住中上部区域，其圆圈图形不易过大，周围零散的星星点点不要包括进去，那可能不是精子而是其他杂质产生的荧光信号。
注意分选过程中进样量在30000 个/秒之间，液滴延迟位置不发生变化，以确保纯度。
如只取 X 精子样品，则其余精子（Y 精子、死精子）流入废液罐。X 精子样品用 2ml 含 20%卵黄的 Tris-A 液回收。分取结束时卵黄的最终浓度得保证在 3%以上。为提高冷冻后精液的活力，每隔15 分钟轻轻摇动一次。当死精率达到 25%以上时停止分离，换新样品。在分选过程中，随时观察液流、图像、死精率等变化，及时调整，保证分选质量。
